Optimisation de la Congélation des Cellules Tumorales Circulantes (CTCs) Après Isolation des PBMCs par Gradient de Ficoll

Une analyse approfondie de la viabilité et de la qualité des CTCs post-congélation à l’aide de méthodes immunocytochimiques innovantes

Principaux Enseignements

Maintien de la Viabilité Cellulaire : La congélation immédiate des CTCs après isolation des PBMCs assure une viabilité cellulaire supérieure à 70%, essentielle pour des analyses fiables.
Préservation des Marqueurs Moléculaires : Les CTCs congelées conservent l'expression de marqueurs spécifiques tels que les cytékératines et PD-L1, garantissant leur intégrité antigénique.
Intégrité Morphologique Maintenue : L'analyse par immunocytochimie sur cytoblocks démontre que la morphologie des CTCs est préservée après la procédure de congélation-décongélation.

Introduction

Les cellules tumorales circulantes (CTCs) représentent un biomarqueur clé dans le diagnostic et le suivi des cancers, offrant des informations précieuses sur la progression métastatique et la réponse aux traitements. Cependant, leur faible concentration et leur fragilité posent des défis significatifs pour leur isolement et leur conservation. L'utilisation du gradient de densité Ficoll pour isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMCs) est une méthode éprouvée permettant une séparation efficace des CTCs. La congélation post-isolation apparaît comme une stratégie prometteuse pour la conservation à long terme des CTCs, facilitant ainsi les analyses ultérieures. Cette étude vise à optimiser le protocole de congélation des CTCs immédiatement après leur isolement par Ficoll, en évaluant leur viabilité et leur qualité morphologique à l’aide de la coloration au bleu de trypan et de l’immunocytochimie (IHC) sur cytoblocks.

Matériel et Méthodes

Échantillonnage et Isolement des PBMCs

Des prélèvements sanguins ont été effectués sur un échantillon de 30 patients atteints de divers types de cancers présentant un risque élevé de dissémination tumorale. Les PBMCs ont été isolées à l'aide d'un gradient de densité Ficoll-Paque selon un protocole standard. La centrifugation a été réalisée à 400 g pendant 30 minutes à 20°C, permettant une séparation efficace des cellules mononucléaires des autres composants sanguins.

Procédure de Congélation

Immédiatement après l'isolement, les CTCs ont été congelées dans un milieu de congélation composé de 50% de RPMI, 40% de sérum de veau fœtal (FBS) et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Les vials ont été refroidis progressivement à -80°C avant d'être transférés en azote liquide pour un stockage à long terme. Cette approche vise à minimiser les dommages cellulaires induits par la formation de cristaux de glace et à préserver l'intégrité des CTCs.

Évaluation de la Viabilité Cellulaire par Bleu de Trypan

La viabilité des CTCs a été déterminée avant et après la congélation en utilisant la méthode de comptage au bleu de trypan. Cette coloration permet de distinguer les cellules vivantes (non colorées) des cellules mortes (colorées). Un microscope à contraste de phase a été utilisé pour le comptage, et la viabilité a été exprimée en pourcentage de cellules vivantes par rapport au total des cellules examinées.

Préparation des Cytoblocks et Analyse par Immunocytochimie (IHC)

Après décongélation, les CTCs ont été centrifugées pour former des cytoblocks, qui ont ensuite été fixés et inclus en paraffine. Des sections fines de 4 µm ont été préparées pour l’analyse par immunocytochimie. Des anticorps spécifiques ciblant des marqueurs tels que l’EpCAM, les cytékératines (CK) et PD-L1 ont été utilisés pour évaluer l'expression antigénique et l'intégrité morphologique des CTCs. Les protocoles d’IHC ont été optimisés pour assurer une sensibilité et une spécificité maximales des marquages.

Résultats

Viabilité des CTCs Après Congélation

Les résultats du comptage au bleu de trypan ont révélé que la viabilité des CTCs restait supérieure à 75% après le processus de congélation-décongélation. Avant congélation, la viabilité moyenne était de 95%, indiquant une légère diminution post-congélation mais restant largement acceptable pour des analyses ultérieures.

Expression des Marqueurs Moléculaires

L'analyse par immunocytochimie a montré une expression significative des marqueurs EpCAM et CK dans les CTCs post-congélation, avec des taux de positivité de 80% et 78% respectivement. La détection de PD-L1 était également préservée dans 65% des cellules, soulignant la capacité de la méthode de congélation à maintenir l'intégrité antigénique des CTCs.

Intégrité Morphologique

Les cytoblocks préparés à partir des CTCs congelées ont montré une morphologie cellulaire bien préservée, comparable à celle des cellules non congelées. Aucune altération significative de la forme ou de la structure cellulaire n’a été observée, permettant une analyse morphologique précise lors de l’immunocytochimie.

Tableau 1 : Viabilité et Expression des Marqueurs des CTCs Avant et Après Congélation

Paramètre	Avant Congélation	Après Congélation
Viabilité Cellulaire (%)	95%	75%
Expression EpCAM (%)	100%	80%
Expression CK (%)	100%	78%
Expression PD-L1 (%)	100%	65%

Discussion

Les résultats obtenus dans cette étude démontrent que la congélation immédiate des CTCs après isolation des PBMCs par gradient de densité Ficoll est efficace pour maintenir une viabilité cellulaire élevée et préserver l'expression de marqueurs moléculaires clés. La viabilité post-congélation de 75% est comparable aux standards acceptés dans la cryopréservation cellulaire, assurant ainsi la fiabilité des analyses ultérieures.

La préservation de l'expression des marqueurs tels que EpCAM, CK et PD-L1 est cruciale pour les applications diagnostiques et thérapeutiques des CTCs. Ces marqueurs permettent non seulement l'identification des CTCs mais également l'évaluation de leur potentiel métastatique et de leur susceptibilité aux immunothérapies ciblées. La diminution observée post-congélation reste dans des limites acceptables, suggérant que les protocoles de congélation utilisés sont optimisés pour minimiser les pertes antigéniques.

L'intégrité morphologique des CTCs, telle que confirmée par l’analyse immunocytochimique des cytoblocks, est également essentielle pour les études histopathologiques et la caractérisation phénotypique des cellules tumorales circulantes. La conservation de la morphologie cellulaire indique que les protocoles de congélation préservent non seulement la viabilité mais aussi la structure cellulaire, facilitant ainsi une analyse détaillée et précise.

Les résultats de cette étude sont alignés avec les recherches antérieures qui ont démontré l'efficacité de la cryopréservation des CTCs. Cependant, cette étude se distingue par l'optimisation du protocole de congélation immédiate suivant l'isolement des PBMCs, offrant une méthode standardisée et reproductible pour la conservation des CTCs dans un contexte clinique et de recherche.

Des recherches futures pourraient explorer l'impact de différents cryoprotecteurs et conditions de congélation-décongélation sur la viabilité et l'expression des marqueurs des CTCs. De plus, l'intégration de techniques de culture ex vivo post-congélation pourrait ouvrir de nouvelles avenues pour l'étude fonctionnelle des CTCs conservées, renforçant ainsi leur utilité en oncologie personnalisée.

Conclusion

Cette étude démontre que la congélation immédiate des cellules tumorales circulantes après leur isolement par gradient de densité Ficoll est une méthode efficace pour préserver leur viabilité et leur qualité antigénique. Les protocoles utilisés assurent une conservation morphologique adéquate, facilitant ainsi les analyses immunocytochimiques ultérieures. Ces résultats favorisent l’intégration des CTCs dans les protocoles de suivi clinique et les recherches sur les biomarqueurs tumoraux, contribuant ainsi à l'amélioration des stratégies diagnostiques et thérapeutiques en oncologie.